Graphenoxid

Scientific Reports Band 6, Artikelnummer: 21867 (2016) Diesen Artikel zitieren

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Graphenoxid (GO) wird von bestimmten exoelektrogenen Bakterien reduziert, seine Auswirkungen auf das Bakterienwachstum und den Stoffwechsel sind jedoch umstritten. Ziel dieser Studie war es herauszufinden, ob GO als terminaler Elektronenakzeptor fungiert, um das spezifische Wachstum und die Stromerzeugung durch exoelektrogene Bakterien zu ermöglichen. Die Kultivierung von Umweltproben mit GO und Acetat als alleinigem Substrat könnte exoelektrogene Bakterien spezifisch anreichern, wobei Geobacter-Arten vorherrschen (51–68 % der Gesamtpopulationen). Interessanterweise aggregierten Bakterien in diesen Kulturen zusammen mit biologisch reduziertem GO (rGO) zu einem leitfähigen Hydrogelkomplex. Ein neuartiges GO-atmendes Bakterium mit der Bezeichnung Geobacter sp. Stamm R4 wurde aus diesem Hydrogelkomplex isoliert. Dieser Organismus zeigte eine stabile Stromproduktion bei >1000 μA/cm3 (bei 200 mV vs. Ag/AgCl) über mehr als 60 Tage über rGO, während eine vorübergehende Stromproduktion unter Verwendung von Graphitfilz erfolgte. Die bessere Stromproduktion hängt von den Eigenschaften von rGO ab, wie z. B. einer großen Oberfläche für das Biofilmwachstum, einer größeren Kapazität und einem kleineren Innenwiderstand. Dies ist der erste Bericht, der das GO-abhängige Wachstum von exoelektrogenen Bakterien bei der Bildung eines leitfähigen Hydrogelkomplexes mit rGO zeigt. Der einfache Put-and-Wait-Prozess, der zur Bildung von Hydrogelkomplexen aus rGO und Exoelektrogenen führt, wird breitere Anwendungen von GO in bioelektrochemischen Systemen ermöglichen.

Bioelektrochemische Systeme (BES)1 oder mikrobielle elektrochemische Systeme (MES)2 sind Geräte für elektrochemische Reaktionen, bei denen Mikroorganismen als Katalysatoren eingesetzt werden. Mikrobielle Brennstoffzellen (MFCs) sind ein Vertreter von BESs, die durch mikrobielle Oxidation organischer Verbindungen Elektronen für eine Elektrode erzeugen3. Exoelektrogene Bakterien zeichnen sich durch ihre einzigartige Funktion namens extrazellulärer Elektronentransfer (EET)4 aus und sind Vermittler bei der Stromerzeugung in BESs. Mitglieder der Gattungen Geobacter und Shewanella sind die am besten untersuchten Exoelektrogene, die Elektronen direkt durch Bindung an die Elektrode und indirekt über Redoxmediatoren übertragen können5,6.

Die Leistung von BESs hängt hauptsächlich mit der EET in bakteriellen Biofilmen zusammen, die sich auf der Elektrode entwickeln, weniger jedoch mit der indirekten EET durch Planktonzellen innerhalb des Geräts7. Daher ist das Elektrodenmaterial ein wichtiger Faktor für die Bildung von Biofilmen und die Leistung des Elektronentransfers an der Zell-Elektroden-Grenzfläche. Da Kohlenstoffelektroden chemisch stabil sind und sich gut für die Entwicklung bakterieller Biofilme eignen, wird dieser Elektrodentyp vorzugsweise bei BESs8,9 eingesetzt. Aufgrund ihrer kommerziellen Verfügbarkeit, experimentellen Leistung und ihres wirtschaftlichen Nutzens wurden insbesondere Graphitfilz, Kohlebürste und Kohletuch für den praktischen Einsatz in Betracht gezogen. Einer der möglicherweise wichtigen Faktoren, die die Leistung von Elektroden beeinflussen, ist die Oberfläche. Eine Elektrode mit einer größeren Oberfläche kann die Anlagerung von mehr Bakterienzellen ermöglichen als eine Elektrode aus reinem Kohlenstoff oder Graphit10. Ein neuerer technischer Fortschritt in diesem Forschungsbereich ist die Modifikation der Anode durch die Verwendung von Graphenderivaten, die eine höhere Leistung aufweisen11,12,13.

Graphen, ein einschichtiges Wabengitter aus Kohlenstoffatomen, hat den Vorteil einer hohen Leitfähigkeit und großer Oberflächen in verschiedenen Größenordnungen, z. B. 2965 m2/g für Graphen14 und 0,02 m2/g für Graphitfilz10. Es ist jedoch schwierig, Graphen direkt auf BESs aufzutragen, da es aus hydrophobem Pulver besteht und für die Verwendung in BESs ein Komplex mit unterstützenden Elektroden sein muss. Es wurde gezeigt, dass die Zugabe von Graphenoxid (GO), der oxidierten Form von Graphen, zur Reaktionskammer in BESs den Elektronentransfer zur Kohlenstoffelektrode verbessert15,16. GO selbst ist nicht elektrisch leitfähig, wird aber zum Leiter, wenn es durch Mikroorganismen reduziert wird17,18. Hier wird diese reduzierte Form von GO einfach als reduziertes GO (rGO) bezeichnet, da keine Informationen zu seiner chemischen Identität verfügbar sind. Die bakterielle Reduktion von GO wurde zunächst in Kulturen von Shewanella-Arten und später in Escherichia coli19 und komplexen Mischpopulationen20 nachgewiesen. Shewanella-Arten reduzierten GO durch Verwendung des Redoxproteins, das an EET17,18 beteiligt ist. Außerdem wurde GO im zellfreien Extrakt einer Shewanella-Kultur17 reduziert, möglicherweise durch kleine Biomoleküle wie Vitamin C21. Diese Ergebnisse werfen die Frage auf, ob GO als Elektronenakzeptor für die EET-Kopplung mit Oxidation des Substrats in exoelektrogenen Bakterien dient und dadurch deren Wachstum ermöglicht. Bisher konnte das Bakterienwachstum durch GO-Atmung noch nicht vollständig nachgewiesen werden. Andererseits wurde auch gezeigt, dass GO eine antibakterielle oder bakterizide Wirkung hat22,23. Diese Ergebnisse liefern eine weitere Annahme, dass GO als einfache Elektronensenke, aber nicht als terminaler Elektronenakzeptor fungiert, um das Wachstum der Atmung zu ermöglichen. Daher sind die Informationen über die Auswirkungen von GO auf das Bakterienwachstum und den Stoffwechsel derzeit unvollständig und unbestimmt. Diese Situation hat die Anwendung von GO auf BES eingeschränkt.

GO bietet potenziell größere Vorteile als Graphen bei der Anwendung auf BESs, teils weil GO wirtschaftlicher als Graphen ist und teils weil die Hydrophilie von GO in wässrigen Lösungen die Anlagerung von mehr Bakterienzellen an seine Oberfläche ermöglichen könnte. Wenn GO als terminaler Elektronenakzeptor fungieren kann, der das Wachstum exoelektrogener Bakterien unterstützt, könnte GO für die selektive Anreicherung dieser Bakterien aus der Umgebung nützlich sein. Es ist auch von großem Interesse festzustellen, dass GO bei chemischer Reduktion in wässrigen Lösungen selbst zu einem Hydrogel aggregierte24. Dies lässt uns erwarten, dass GO für die Bildung eines hochdichten Montagekomplexes aus EET-treibenden Exoelektrogenen und leitfähigem rGO geeignet ist.

Der Hauptzweck dieser Studie bestand darin, festzustellen, ob in Abhängigkeit von GO selektives Wachstum und Selbstaggregation exoelektrotrogener Bakterien stattfinden. Zu diesem Zweck haben wir versucht, Anreicherungskulturen von GO-atmenden Bakterien (GORBs) aus der Umwelt herzustellen und diese GORBs auf die Stromerzeugung über EET zur Elektrode untersucht. Die phylogenetische Zusammensetzung der angereicherten GORBs wurde durch Hochdurchsatzsequenzierung von 16S-rRNA-Genamplikons bestimmt. Wie hier berichtet, führten unsere Versuche, einen leitfähigen Hydrogelkomplex aus GORBs und rGO herzustellen, zu positiven Ergebnissen. Nach unserem besten Wissen ist diese Studie die erste, die ein GO-abhängiges Wachstum exoelektrotrogener Bakterien zeigt, begleitet von der Selbstaggregation zu einem Hydrogelkomplex mit rGO, der zur Stromerzeugung fähig ist.

Die in dieser Studie verwendeten GO-Proben wurden kommerziell als Pulver erworben und durch zweistündige Ultraschallbehandlung in Wasser dispergiert. Das vorbereitete GO bestand fast aus einschichtigen Schichten mit einer Dicke von 1, 5 nm, wie in AFM-Bildern zu sehen ist, und wies zahlreiche C = O-Peaks bei 287 eV und einen CC / CH-Peak bei 285 eV in XPS auf (ergänzende Abbildung S1). Die Fläche der GO-Blätter war variabel und lag im Durchschnitt bei 0,26 ± 0,46 μm.

Zur Anreicherung von GORBs aus Umweltproben wurde Acetat als einzige Kohlenstoff- und Energiequelle verwendet. Die Redoxpotentiale von Acetat und einem chemisch reduzierten GO betrugen −290 mV25 bzw. +380 mV26 gegenüber SHE (Standard-Wasserstoffelektrode). Der Unterschied im Reduktionspotential zwischen beiden ist thermodynamisch günstig für die Energieerzeugung und das daraus resultierende Wachstum durch respiratorische GO-Reduktionskopplung mit Acetatoxidation.

Die Anreicherung von GORBs wurde unter Verwendung von drei verschiedenen Süßwasserumweltproben als Samen durchgeführt, nämlich Flusswasser (RW), Reisboden (PS) und Wasserkanalsediment (WC). Diese Proben wurden mehrere Tage mit GO und Acetat inkubiert. Anschließend wurden Teile der Kulturen auf frisches Medium übertragen, um die Kultivierung fortzusetzen. Durch wiederholten Transfer und mehr als zehnmalige Kultivierung erhielten wir hochangereicherte Kulturen, die als Kulturen RW, WC und PS bezeichnet werden.

Zu Beginn des Anreicherungsprozesses war das zugesetzte GO vollständig in den Kulturen verteilt, was zu braunen Suspensionen führte (Abb. 1A). Anschließend verfärbten sich die Kulturen nach und nach schwarz und bildeten während einer Inkubationszeit von 10 Tagen einen dichten Hydrogelkomplex. Eine XPS-Analyse zeigte, dass das GO in den drei Kulturen C1s-Spektren mit jeweils zwei Hauptpeaks bei etwa 287 eV für C = O und 285 eV für CC/CH-Bindungen bei 0 d aufwies (Abb. 1B). Der C=O-Peak dominierte zunächst und sank mit der Zeit in allen Kulturen allmählich ab. Unterdessen wurde der CC/CH-Peak dominant und der C = O-Peak verschwand fast. In den autoklavierten Kulturen als Kontrolle wurden keine oder nur geringe Veränderungen im Aussehen und im XPS-Peak beobachtet (Abb. 1A, B). Diese Beobachtungen zeigten, dass die Reduzierung von GO, gemessen an der Farbänderung von Braun nach Schwarz, von der mikrobiellen Aktivität abhängt.

GO-abhängiges Wachstum und Selbstaggregation mikrobieller Zellen in Anreicherungskulturen.

(A) Aussehen der drei Anreicherungskulturen (Kulturen-RW, -PS, -WC), die mit autoklavierten und intakten Zellen beimpft wurden und die Bildung eines selbstaggregierten Hydrogelkomplexes zeigen. (B) XPS-Daten von GO und dem teilweise reduzierten GO in den Kulturen mit autoklavierten oder intakten Inokula nach 10 Tagen. (C) Acetatkonzentration in den Kulturen mit und ohne GO nach 10 Tagen. (D) Zelldichte in den Kulturen mit und ohne GO und Acetat (ACE) nach 10 Tagen.

In den drei Anreicherungskulturen wurde Acetat zusammen mit der Reduktion von GO verbraucht, blieb jedoch in der Kontrolle ohne GO unverändert (Abb. 1C). Die gleichzeitige Abnahme der C = O-Peakintensität und der Acetatkonzentration ließ darauf schließen, dass die GO-Reduktion mit der Acetatoxidation einherging. Wenn der Hydrogelkomplex durch Homogenisierung in der wässrigen Phase dispergiert wurde, war die Zelldichte in den mit GO und Acetat veränderten Kulturen etwa 20-fach höher als in den Kulturen ohne einen Zusatz oder beides und betrug (4,0–7,6) × 106 Zellen/ml (Abb. 1D). Angesichts der Tatsache, dass die vorliegenden Bakterien für ihr Wachstum sowohl GO als auch Acetat benötigten, ist es logisch, den Schluss zu ziehen, dass dieses Wachstum tatsächlich von der anaeroben Atmung mit GO als terminalem Elektronenakzeptor und Acetat als Kohlenstoff- und Energiequelle abhängt.

In den Anreicherungskulturen mit GO waren 80 ± 12 % der Zellen im entwickelten Hydrogelkomplex verteilt (Tabelle 1). Die REM-Aufnahme des Hydrogelkomplexes ergab, dass auf der Oberfläche des Komplexes bakterielle Zellstrukturen eingeschlossen waren (Abb. 2). Die Morphotypen der Bakterien in den drei Kulturen waren einander ähnlich, da gebogene Stäbchen reichlich vorhanden waren und gelegentlich Kokken beobachtet wurden. Diese Zellstrukturen wurden vor der Inkubation auf GO selbst nicht beobachtet.

REM-Bilder von GO und den rGO-GORBs-Komplexen.

(A) SEM-Bild von GO, das in dieser Studie verwendet wurde. (B–D) SEM-Bilder der rGO-RGOBs-Komplexe in Kultur-RW (B), -PS (C), -WC (D).

Um Bakterien in den schwarzen Hydrogelkomplexen von rGO und GORBs zu identifizieren, wurden 16S-rRNA-Gene aus diesen Komplexen PCR-amplifiziert und durch Hochdurchsatzsequenzierung mit der Illumina MiSeq-Plattform analysiert. In allen drei Kulturen waren die 16S-rRNA-Gene von Geobacter-Arten, bekannten exoelektrogenen Bakterien, am häufigsten anzutreffen und machten 51–68 % der gesamten Amplifikate aus (Abb. 3). Neben den Geobacter-Bakterien wurden in allen drei Kulturen signifikant Vertreter von Azospira nachgewiesen, die 28–42 % der Gesamtpopulation ausmachen. Azospira-Arten, bei denen es sich um Acetatoxidationsmittel handelt, wurden häufig in der Anodenkammer von MFCs27,28 nachgewiesen.

Identifizierung von mit GO gezüchteten Bakterien.

Die Kreisdiagramme der phylogenetischen Identifizierung operativer taxonomischer Einheiten (OTUs) in drei Kulturen (Kultur-RW, -PS, –WC). Die OTUs mit einer Häufigkeit von mehr als 1 % wurden in den Diagrammen angezeigt.

Wie oben erwähnt, haben wir die rGO-GORB-Hydrogelkomplexe durch den Anreicherungsprozess mit GO und Acetat erfolgreich erhalten. Um die Fähigkeit dieser Komplexe sicherzustellen, Acetat in Elektrizität umzuwandeln, wurden sie bei +200 mV (gegenüber Ag/AgCl) polarisiert. In allen drei Komplexen wurde schnell Strom erzeugt, wobei der maximale Wert an den Tagen 1–2 im Bereich von 1.000–1.300 μA/cm3 lag (Abb. 4A). Die Stromproduktion nahm im Laufe der Zeit allmählich ab, erholte sich jedoch bei Erhöhung der Acetatkonzentration. Die sofortige und stabile Stromerzeugung war auf ein signifikantes Wachstum und eine stabile Aktivität der GO-reduzierenden Exoelektrotrogene in den Komplexen nach der Polarisation zurückzuführen. Nach 10–20 Tagen der Polarisation mit der dreifachen Zugabe von 5,0 mM Acetat lag die Gesamtzellzahl in den drei Kulturen im Bereich von (3,7–4,9) × 109 bis (0,53–3,8) × 1012 Zellen/Kultur (Tabelle 1) und 64–89 % waren innerhalb der Komplexe anwesend. Die Zelldichte pro Volumeneinheit war in den Komplexen 160-fach höher (0,5 × 1011 bis 3,1 × 1011 Zellen/cm3) als in der flüssigen Phase mit Planktonzellen (1,7 × 108 bis 5,3 × 108 Zellen/ml). In allen Komplexen stellten Geobacter-Arten die überwältigende Mehrheit (77–91 %) der elektrochemisch gewachsenen Populationen (Ergänzungstabelle S1).

Stromerzeugung durch die rGO-GORBs-Komplexe.

(A) Änderungen der Elektrizität, die von den mit RW, PS und WC geimpften rGO-GORBs-Komplexen erzeugt wird. (B) CV, erhalten durch die drei rGO-GORBs-Komplexe. (C) EIS, erhalten durch die drei rGO-GORBs-Komplexe. Die in der Grafik angezeigten Zahlen sind Frequenzen: f [Hz] = ω/2π.

Die CV-Kurven für die drei rGO-GORB-Komplexe zeigten den katalytischen Strom der Acetatoxidation, z. B. 1200–1700 μA/cm3 bei 500 mV gegenüber Ag/AgCl mit einer Scanrate von 0,2 mV/s (Abb. 4B). Es trat kein offensichtlicher Redoxpeak auf. Die Voltammogramme für die Kulturen RW und PS zeigten überhöhte symmetrische Stromentladungen, was darauf hinweist, dass die elektrische Doppelschichtkapazität von der großen Oberfläche der rGO-GORBs-Komplexe abhängt. In der WC-Kultur verlief die CV-Kurve bei niedrigeren Potenzialen schief. Auf der Grundlage des Nyquist-Diagramms unter Verwendung von Rohdaten für die drei Komplexe (Abb. 4C) betrugen die Ladungsübertragungswiderstände (Rct), ausgedrückt als Durchmesser von Halbkreisen, <1,0 Ω/cm3 in den Kulturen RW und PS und 1,0–2,0 Ω/cm3 im Kultur-WC. Die beiden scheinbaren Halbkreise in WC deuteten darauf hin, dass zwei elektrochemische Reaktionen beteiligt waren. Der kleinere Halbkreis ähnelte denen, die in den RW- und PS-Kulturen beobachtet wurden, was darauf hindeutet, dass eine elektrochemische kinetische Reaktion von Geobacter stattgefunden hat. Der größere Halbkreis zeigte möglicherweise die Beteiligung elektrochemischer kinetischer Reaktionen durch andere Bakterien wie Sulfurospirillum-Arten, die sicherlich in WC gewachsen sind (13 % der Gesamtpopulation), aber nicht oder weniger gewachsen sind (<0,1 %) in RW und PS (Ergänzungstabelle S1).

Um festzustellen, ob die angereicherten Geobacter-Bakterien tatsächlich durch GO-Atmung wachsen können, wurden Versuche unternommen, Geobacter aus den Anreicherungskulturen durch anaerobe Agarkultivierung mit GO zu isolieren. Als Ergebnis ergab die RW-Kultur kleine Kolonien mit einem großen schwarzen Hof im Agarmedium, die positiv für die GO-Reduktion waren (Abb. 5A). Eine einzelne Kolonie dieser Agarplatte wurde durch wiederholte Agarverdünnung erfolgreich gereinigt und als Stamm R4 entworfen. Durch 16S-rRNA-Gensequenzierung wurde der Stamm R4 tatsächlich als Mitglied der Gattung Geobacter identifiziert, wobei der Geobacter bremensis-Stamm Df1T (Zugangsnummer U96917) mit einem Ähnlichkeitsgrad von 99,3 % der nächste Verwandte ist.

GO-abhängiges Wachstum und Selbstaggregation von Geobacter sp. Stamm R4-Zellen.

(A) Schwarze Halo-Bildung durch Stamm R4 in einer Agarplatte als positiv für die GO-Reduktion. (B) GO-Reduktion und Selbstaggregation von Zellen zu einem Hydrogelkomplex in den R4-Kulturen, die mit intakten (oberen) und autoklavierten (unteren) Inokula beimpft wurden. (C) XPS-Daten von C1s-Spektren in der intakten R4-Kultur. (D) Acetatkonzentration in den intakten R4-Kulturen mit und ohne GO. (E) Die Anzahl der 16S-rRNA-Genkopien in den intakten R4-Kulturen mit und ohne GO und Acetat (ACE).

Eine Reinkultur von Geobacter sp. Stamm R4 war in der Lage, GO zu reduzieren und mit rGO einen schwarzen Hydrogelkomplex (rGO-R4-Komplex) zu bilden, ähnlich dem, der in der Kultur RW beobachtet wurde (Abb. 5B, C). Stamm R4 benötigte 30 Tage, um den rGO-R4-Komplex zu bilden, während es in der Mischkultur 10 Tage dauerte, um den rGO-RW-Komplex zu bilden. Das anaerobe Wachstum des Stamms R4 erfolgte zusammen mit dem Acetatverbrauch und der GO-Reduktion (Abb. 5D, E). In einer XPS-Analyse von drei Proben, die an verschiedenen Positionen des Komplexes am Tag 36 entnommen wurden, wurden die reichlich vorhandenen CC-Bindungen als Haupt-C1s-Peak wiederholt beobachtet (ergänzende Abbildung S2), was darauf hindeutet, dass GO im Komplex vollständig reduziert war. Die elektrische Leitfähigkeit des rGO-R4-Komplexes betrug 16 mS/cm, was viel höher ist als die, die für das ursprüngliche GO durch mikrobielle Reduktion aufgezeichnet wurde (Ergänzende Abbildung S3A, B).

Diese Ergebnisse zeigen, dass Geobacter sp. Stamm R4 ist in der Lage, durch GO-Atmung ohne Verbindung mit anderen Mikroorganismen anaerob zu wachsen und mit rGO ein leitfähiges Hydrogel zu bilden.

Der rGO-R4-Komplex wurde auf seine Fähigkeit zur Stromerzeugung untersucht. Zum Vergleich wurde Graphitfilz (GF) verwendet, eine repräsentative Anode, die häufig in MFCs verwendet wird. In beiden Komplexsystemen betrug die Anzahl der vorhandenen Zellen etwa 8,0 × 108 Zellen/Komplex. Zellen des Stamms R4 erzeugten in beiden Komplexen innerhalb von 7 Tagen Strom mit 1.300–1.700 μA/cm3, zeigten jedoch je nach verwendeten Anoden unterschiedliche Produktionsprofile (Abb. 6A). Die Elektrizität im GF-R4-Komplex nahm mit der Zeit allmählich ab und konnte durch Aufstocken mit Acetat nicht wiederhergestellt werden, während die Elektrizität im rGO-R4-Komplex stabil erzeugt wurde. Diese Ergebnisse wurden in wiederholten Tests gut reproduziert, wie in der ergänzenden Abbildung S2 gezeigt. Die Acetatkonzentration in der rGO-R4-Kultur sank nach 20 Tagen Inkubation unter die Nachweisgrenze. Andererseits verblieb mehr als die Hälfte des zugesetzten Acetats (8,0 mM) noch in der GF-R4-Kultur (Ergänzende Abbildung S4). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die rGO-R4-Kultur Acetat viel effizienter oxidieren und Strom erzeugen kann als die GF-R4-Kultur.

Stromproduktion durch Geobacter sp. Belastung R4 mit GO und Graphitfilz als Anode.

(A) Änderungen der Elektrizität in den Komplexen rGO-R4 (grün) und GF-R4 (lila). (B) Aussehen der rGO-R4- und GF-R4-Komplexe nach 30 Tagen Inkubation. (C) SEM-Bild der rGO-R4- und GF-R4-Komplexe nach 30 Tagen Inkubation. (D) CV-Kurven, die von den rGO-R4- und GF-R4-Komplexen erhalten wurden. (E) EIS-Daten, die von den rGO-R4- und GF-R4-Komplexen erhalten wurden. Der Einschub zeigt die vergrößerten gleichen Daten in einem schmalen Bereich. Die in der Grafik angezeigten Zahlen sind Frequenzen: f [Hz] = ω/2π.

Die rGO-R4-Komplexe verfärbten sich nach einer Woche Polarisation rosa (Abb. 6B). Diese zeitabhängige Färbung ähnelte der typischen Färbung des mehrschichtigen Biofilms von Geobacter. Die Zelldichte im rGO-R4-Komplex änderte sich von 8,0 × 108 Zellen/cm3 auf 3,6 × 1010 Zellen/cm3 und machte 93 % der Gesamtpopulation in der gesamten Kultur aus (Tabelle 2). Die SEM-Beobachtung zeigte, dass die Oberfläche des rGO-R4-Komplexes tatsächlich mit reichlich Zellen bedeckt war (Abb. 6C). Alle diese Ergebnisse legen die Bildung eines mehrschichtigen Biofilms auf dem rGO-R4-Komplex durch elektrische Polarisation nahe. Im Gegensatz dazu entwickelte sich in der GF-R4-Kultur kein offensichtlicher Biofilm, sondern es bildete sich eine rosafarbene, trübe flüssige Phase (Abb. 6B). Die Gesamtzellmasse in der GF-R4-Kultur betrug nicht mehr als 6,4 % derjenigen in der rGO-R4-Kultur (Tabelle 2) und 64 % der Zellen waren planktonisch. Dieser geringere Biomassegehalt könnte mit den elektrochemischen und physiologischen Profilen in der GF-R4-Kultur zusammenhängen.

Um die Auswirkung der Hydrogelstruktur des rGO-R4-Komplexes auf die Stromerzeugung zu bewerten, wurde Stamm R4 elektrisch unter Verwendung von mit oder ohne GO beschichtetem Graphit kultiviert (Ergänzende Abbildungen S5 und S6). In beiden Kulturen bildete Stamm R4 Biofilme auf der Graphitoberfläche (Ergänzungstabelle S3) und erzeugte Elektrizität. Anders als im Hydrogel-Komplex nahm die Stromproduktion in beiden Kulturen jedoch mit der Zeit allmählich ab. Diese Ergebnisse zeigen, dass die Hydrogelstruktur wichtig ist, um die Stromproduktion durch Stamm R4 aufrechtzuerhalten.

Die CV-Analyse des rGO-R4-Komplexes nach der Polarisation zeigte einen viel höheren katalytischen Strom (1.300 μA/cm3) im rGO-R4-Komplex bei 500 mV (gegen Ag/AgCl) als im GF-R4-Komplex (470 μA/cm3). ) (Abb. 6D). Die höhere Stromerzeugung bei rGO war wahrscheinlich auf die größere Kapazität und den viel kleineren Widerstand zurückzuführen als bei GF (Abb. 6E). EIS-Daten zeigten eindeutig einen 10-fach kleineren Rct im rGO-R4 als im GF-R4-Komplex, d. h. <1,0 Ω/cm3 bzw. >10 Ω/cm3. Bei idealen elektrochemischen kinetischen Reaktionen ist die Kapazität (C) umgekehrt proportional zu Rct und der Kreisfrequenz (ωmax), die die Spitze des Halbkreises zeigt (ωmaxCRct = 1). Daher kann geschätzt werden, dass die Kapazität in rGO-R4 größer ist als die von GF-R4.

Eine bessere Leistung des rGO-R4-Komplexes wurde auch bereits vor der elektrischen Polarisation beobachtet (Ergänzende Abbildung S7). Die Ergebnisse zeigten deutlich, dass der rGO-R4-Komplex vor der Bildung des Biofilms ursprünglich eine elektrische Doppelschichtkapazität und einen geringen Ladungsübertragungswiderstand aufwies. Der nach der Polarisation auf dem Komplex gebildete Biofilm zeigte eine elektrische Leitfähigkeit von 0,46 mS/cm, was viel niedriger ist als der Wert für den rGO-Komplex (16 mS/cm). Diese Ergebnisse zeigten, dass die größere elektrische Kapazität und der geringere Ladungsübertragungswiderstand vom Hydrogelkomplex selbst und nicht vom Biofilm auf dem Komplex bereitgestellt wurden, obwohl dies möglicherweise teilweise vom Biofilm unterstützt wurde.

Obwohl GO ein vielversprechendes Nanomaterial für die Anwendung in BES ist, ist es im Zusammenhang mit seinen Auswirkungen auf das Bakterienwachstum und den Stoffwechsel umstritten. Im letzten Jahrzehnt haben zahlreiche Studien gezeigt, dass GO eine antibakterielle oder bakterizide Wirkung auf eine Vielzahl von Arten hat22,23,29,30. Das Hauptziel dieser Studie bestand daher darin, festzustellen, ob GO als terminaler Elektronenakzeptor fungiert, um das Wachstum exoelektrotrogener Bakterien zu unterstützen, und unser Versuch, dies zu zeigen, war erfolgreich. Das GO-abhängige Wachstum ermöglichte die selektive Anreicherung exoelektrotrogener Bakterien im Komplex (Abb. 1 und 3). Die Verwendung dieses Verfahrens bietet einen größeren Vorteil bei der Reduzierung von GO als andere abiotische GO-Reduktionstechniken. Die inkonsistenten Ergebnisse der früheren Studien, die eine antibakterielle Aktivität zeigten, und unserer sind wahrscheinlich auf Unterschiede in den Versuchsbedingungen bei der GO-Einrichtung zurückzuführen. Jüngste Artikel haben darauf hingewiesen, dass die antibakterielle Aktivität von GO nur auf der mit kleinem GO beschichteten Oberfläche nachweisbar ist, nicht jedoch in der wässrigen Lösung31,32. Daher könnte das Wachstum von exoelektrogenen Bakterien, die wir gefunden haben, durch den nicht-zytotoxischen Zustand von GO in wässriger Lösung induziert werden31.

Eine der auffälligsten Beobachtungen dieser Studie ist, dass die Kultivierung von Umweltproben zur Bildung selbstaggregierter Hydrogelkomplexe aus exoelektrogenen Bakterien und rGO führte, die als Leiter fungieren können. Der Mechanismus dieser Hydrogelbildung ist mit Sicherheit unbekannt, wird jedoch möglicherweise durch eine teilweise π-π-Stapelung des rGO verursacht, wie zuvor bei der hydrothermischen Reduktion von GO zum rGO-Hydrogel beobachtet wurde24. Daher hängt die Bildung von rGO-Hydrogel wahrscheinlich von der Fähigkeit der Bakterien ab, GO zu reduzieren. Als Shewanella-Arten17,18 und Escherichia coli19 mit GO kultiviert wurden, lag das resultierende rGO in Form von Flocken vor, jedoch nicht in Form eines Hydrogelkomplexes. Dennoch können diese Bakterienarten unter denselben Kulturbedingungen wie in dieser Studie das rGO-Hydrogel bilden. Somit liefert die vorliegende Studie ein neues Modell von Bioleitern als hochdichte Ansammlung von rGO und Bakterien.

Wie hier berichtet, sind die mit GO aus der Umwelt in die Hydrogelkomplexe angereicherten Geobacter-Populationen viel höher als die in natürlichen Umgebungen wie Reisböden33, Feuchtgebietssedimenten34 und Grundwasserleitersedimenten35 nachgewiesenen Populationen. Es ist auch erwähnenswert, dass die rGO-GORBs-Komplexe höhere Geobacter-Populationen umfassten als MFC, die mit Acetat gefüttert wurden, wobei Geobacter 14–60 % der Gesamtpopulation ausmachte36,37,38,39. Dies legt nahe, dass die Kultivierung mit GO im Vergleich zum herkömmlichen System unter elektrischer Polarisation für die selektive Anreicherung von Geobacter und anderen EET-treibenden Bakterien nützlicher ist. Neben Geobacter-Arten wurden in den Anreicherungskulturen auch Mitglieder von Azospira in signifikanten Anteilen (insgesamt 28–41 %) nachgewiesen. Obwohl Azospira-Arten häufig in MFC27,28 nachgewiesen wurden, wurde von keiner von ihnen berichtet, dass sie extrazelluläre Elektronenakzeptoren reduziert. Eines der charakteristischen Merkmale von EET-treibenden Bakterien wie Geobacter- und Shewanella-Arten40 ist die Fähigkeit, Huminstoffe zu oxidieren, und in ähnlicher Weise wurde berichtet, dass ein Azospira-Stamm Huminstoffe oxidiert41. Basierend auf diesen kollektiven Ergebnissen kann man davon ausgehen, dass die Azospira-Bakterien in den rGO-GORBs-Komplexen an der GO-Reduktion beteiligt sind. Im Kultur-WC stieg der Anteil von Sulfurospirillum durch Polarisation von 6,1 % auf 13 %. Vor diesem Hintergrund könnten diese Bakterien zusammen mit der Tatsache, dass Mitglieder von Sulfurospirillum in der Lage sind, Eisenoxide zu EET umzuwandeln42, eine Rolle bei der Stromerzeugung im rGO-GORBs-Komplex spielen.

Geobacter sp. Stamm R4, ein in dieser Studie neu isoliertes Bakterium, zeigte mit rGO Biofilmwachstum und stabile Stromproduktion, während er mit GF planktonisches Wachstum und vorübergehende Stromproduktion zeigte (Abb. 6). Dieser Unterschied in den bioelektrochemischen Merkmalen zwischen den beiden Kulturen legt nahe, dass Stamm R4 den EET-Modus abhängig von den Kohlenstoffmaterialien ändert, d. h. direkter EET zu rGO und indirekter EET zu GF über wässrige Redoxmoleküle. Es wurde gezeigt, dass bei exoelektrogenen Geobacter-Arten der direkte EET durch Proteine ​​der äußeren Membran, einschließlich Cytochromen vom C-Typ und leitfähigem Biofilament, katalysiert wird. Das planktonische Zellwachstum von Shewanella oneidensis43 unter Polarisation wird mit der Produktion von Elektronenshuttles wie Flavinen44 in Verbindung gebracht. Bemerkenswert ist, dass in dieser Studie erstmals die elektrodenabhängige Umschaltung des EET-Modus durch eine Reinkultur festgestellt wurde. Die einzigartigen Eigenschaften von Geobacter sp. Stamm R4 wird einen neuen Einblick in das umfassende Verständnis der Wechselwirkung von exoelektrogenen Bakterien mit Kohlenstoffelektroden liefern.

Nach unserem besten Wissen ist diese Studie die erste, die ein GO-abhängiges selektives Wachstum exoelektrotrogener Bakterien und die Bildung eines selbstaggregierten Hydrogelkomplexes aus Biomasse und rGO nachweist. Der rGO-GORB-Komplex weist ein besseres Biofilmwachstum, einen viel geringeren Innenwiderstand und eine größere Kapazität auf als das von GF verwendete System. Der einfache Put-and-Wait-Prozess, der zur Selbstaggregation im rGO-Biomassekomplex und zur Verstärkung des EET zwischen Bakterien und der Elektrode führt, wird zur Ausweitung der Anwendung von GO in BESs beitragen.

GO-Pulver wurde von Royal Elite New Energy Science & Technology Co., Ltd (Shanghai, China) gekauft. GO wurde in sterilisiertem MilliQ-Wasser gelöst, um eine Konzentration von 10 g/l zu ergeben, mehr als 2 Stunden lang mit einem CPX-Ultraschallgerät von Bransonic (Branson Ultraschall, Emerson Japan, Ltd., Atsugi, Japan) beschallt und bei 4 °C gelagert verwenden. Das so hergestellte GO wurde mit einem Agilent PicoPlus 5500 Rasterkraftmikroskop (Agilent Tech. Inc., Santa Clara, CA) auf Dicke und Flockenfläche analysiert.

Die chemischen Zustände von GO und biologisch reduziertem GO (rGO) wurden mittels Röntgenphotoelektronenspektroskopie (XPS) analysiert. Für diese Analyse wurden GO und rGO auf einem Siliziumwafer abgeschieden und getrocknet. Die Siliziumwafer wurden gesammelt, mehrmals mit MilliQ-Wasser gewaschen und wie zuvor beschrieben17 getrocknet. XPS-Spektren wurden mit einem XPS-Instrument, Versa Probe PHI-5000 (ULVAC-PHI Inc., Osaka, Japan), gemessen, das mit einer monochromatischen Al-Ka-Röntgenquelle ausgestattet war und bei einem bloßen Druck von weniger als 10−6 Pa betrieben wurde. Der Kern Das Niveauspektrum von C1s wurde durch fokussierte Scans nach Durchmusterungsscans über 0–1.100 eV erhalten.

GORBs wurden durch anaerobe Kultivierung von Umweltproben unter Verwendung eines chemisch definierten Mediums mit Acetat als Kohlenstoff- und Energiequelle und GO als Elektronenakzeptor angereichert. Als Saatgut verwendeten wir drei verschiedene Umweltproben, nämlich Flusswasser (entworfen RW, 34°42′22″N, 137°23′31″E), Sediment in einem Wasserkanal (entworfen WC, 34°42′26). ″N, 137°23′42″E) und einem Reisboden (entworfen PS, 34°42′37″N, 137°23′47″E). Die drei Kulturen RW, WC und PS wurden unabhängig voneinander inkubiert und nacheinander in regelmäßigen Abständen auf frisches Medium übertragen, wie in den Hintergrundinformationen beschrieben. Im Anschluss an die Anreicherung wurden GORBs aus den Anreicherungskulturen mithilfe der Agar-Verdünnungstechnik isoliert, wie in den Hintergrundinformationen beschrieben.

Angereicherte und isolierte GORBs wurden phylogenetisch durch Sequenzierung von 16S-rRNA-Genen identifiziert. 16S-rRNA-Gene aus den Anreicherungskulturen wurden mit der Bulk-DNA als Matrize PCR-amplifiziert und mit dem Illumina MiSeq-System wie in den Hintergrundinformationen beschrieben sequenziert. Ein GORB-Isolat aus der Anreicherungskultur wurde einer PCR-Amplifikation des 16S-rRNA-Gens unter Verwendung der Primer 27f und 1492r unterzogen (untermauert Tabelle 1). Das 16S-rRNA-Gen-Amplikon wurde mit einem Applied Biosystems Big Dye Terminator V3.1-Kit (Life Technologies, Carlsbad, CA) und einem Applied Biosystems 3730xl DNA-Analysator (Life Technologies) wie zuvor beschrieben sequenziert45.

Zur Quantifizierung von Acetat in der Kultur wurde ein Teil der Kultur entnommen und mit einem Umkehrphasen-HPLC-System (Shimadzu, Kyoto, Japan) analysiert, das mit L-Säule2 ODS (4,6 × 250 mm) (CERI, Tokio, Japan) ausgestattet war. und ein UV-Detektor wie zuvor beschrieben46. Die direkten Gesamtzellzahlen in den Anreicherungskulturen RW, PS und WC wurden durch Epifluoreszenzmikroskopie mit SYBR GREEN II-Färbung47 bestimmt. Um das Zellwachstum in einer Reinkultur des Stamms R4 zu überwachen, wurde eine Echtzeit-qPCR unter Verwendung eines universellen Primersatzes für die bakteriellen 16S-rRNA-Gene 357f und 517r durchgeführt (Ergänzungstabelle S2). Die qPCR wurde mit einem LightCycler FastStart DNA Master SYBR Green I-Kit (Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis, IN) und dem LightCycler Nano-System (Roche Applied Science, Indianapolis, IN) wie zuvor beschrieben45 durchgeführt. Als Standard wurde das gereinigte 16S-rRNA-Gen-Amplikon aus genomischer DNA des Stamms R4 verwendet.

Für Tests der mikrobiellen Elektrizitätsproduktion in den rGO-GORBs-Komplexen wurden angereicherte und reine Kulturen von GORBs in einer Glasflasche mit einem Fassungsvermögen von 0,93 l (Größe, 90 mm Durchmesser und 175 mm Höhe) mit den folgenden geringfügigen Modifikationen inkubiert. Für den mit Anreicherungskulturen beimpften Komplex wurde 1 l anaerobes Mineralmedium mit der Bezeichnung AGOFS in einer 2 l-Glasflasche zubereitet und autoklaviert (siehe ergänzende Informationen). Für den rGO-R4-Komplex wurde auch AGOSF-Medium vorbereitet. Nach dem Autoklavieren wurde das Medium mit 0,67 g/L GO und 15 ml der Vorkultur gemischt und in eine Glasflasche gefüllt, um den Kopfraum zu entfernen. Anschließend wurde die Glasflasche einen Monat lang bei 28 °C inkubiert. Nach der Inkubation wurde ein Hydrogelkomplex mit etwa 30 mm Durchmesser und 10–20 mm Höhe erhalten.

Für die SEM-Bildgebung wurde der rGO-GORBs-Komplex mit 2 % Glutaraldehyd und 1 % Osmiumtetroxid fixiert, wie in den Hintergrundinformationen beschrieben. Die vorbereiteten Proben wurden mit Gold sputterbeschichtet und dann unter einem Feldemissions-Rasterelektronenmikroskop SU8000 (Hitachi Co., Ltd., Tokio, Japan) bei 1,0 kV beobachtet.

Für die elektrochemische Kultivierung wurde eine sterilisierte Glasflasche mit einem Fassungsvermögen von 0,93 l (90 mm Durchmesser und 175 mm Höhe), verbunden mit einem Platindraht, als Arbeitselektrode verwendet. Die Flasche wurde mit AGOS-Medium (siehe Hintergrundinformationen) gefüllt, dem die rGO-GORB-Komplexe zugesetzt wurden. Zum Vergleich wurde GF mit 30 mm Durchmesser und 20 mm Dicke als repräsentative MFC-Anode verwendet. Der GF wurde in die Zellsuspension von R4 eingetaucht und die GF-haltenden Zellen wurden als GF-R4-Komplex verwendet. Als Referenz- bzw. Gegenelektroden wurden eine Ag/AgCl-Elektrode (KCl-Salz) und ein weiterer Platindraht verwendet. Die Polarisation wurde durchgeführt, indem das Arbeitselektrodenpotential unter Verwendung eines Potentiostaten HA-1510 (Hokuto Denko, Tokio, Japan) auf +200 mV gegenüber Ag/AgCl eingestellt wurde. Während der Polarisation wurde der Strom alle 60 Minuten mit einem Datenlogger (T&D Corporation, Nagano, Japan) aufgezeichnet.

Die Analyse der zyklischen Voltammetrie (CV) und die elektrochemische Impedanzspektroskopie (EIS) der rGO-GORB-Komplexe wurden unter Verwendung eines elektrochemischen Messsystems HZ-7000 (Hokuto Denko, Tokio, Japan) durchgeführt. Die CV- und EIS-Analysen wurden mit derselben Flasche durchgeführt, die auch für die oben beschriebene elektrochemische Kultivierung verwendet wurde, nach 2-stündiger Stabilisierung mit 5,0 mM Acetat. CV wurde mit einer Scanrate von 0,2 mV/s im Potentialbereich von –400 bis 600 mV (gegen Ag/AgCl) durchgeführt. EIS wurde für die rGO-GORB-Komplexe in einem Frequenzbereich von 100 kHz – 0,5 MHz bei 200 mV mit 20 mV Amplitude für das angelegte Wechselstromsignal untersucht. Die Nyquist-Diagramme wurden mit der EIS-Datenanalysesoftware ZSimpWin (Princeton Applied Research, Oak Ridge, TN) analysiert. CV- und EIS-Analysen wurden bei 10 Tagen Polarisation für die Komplexe aus RW- und PS-Kulturen und bei 20 Tagen für den Komplex aus WC-Kulturen durchgeführt. Für die Komplexe mit Stamm R4 wurden Daten bei 7d und 12d der Polarisation aus den rGO- und GF-Komplexen von Lauf2 erhalten (ergänzende Abbildung S2).

Die in dieser Studie ermittelte 16S-rRNA-Gensequenz des Stamms R4 wurde unter der DDBJ-Zugangsnummer LC076693 (http://www.ddbj.nig.ac.jp/Welcome-j.html) hinterlegt. Ein kompilierter Satz der Illumina MiSeq-Sequenzen wurde in der Short Read Archive-Datenbank unter der Zugangsnummer DRA003954 hinterlegt.

Zitierweise für diesen Artikel: Yoshida, N. et al. Graphenoxid-abhängiges Wachstum und Selbstaggregation zu einem Hydrogelkomplex aus exoelektrogenen Bakterien. Wissenschaft. Rep. 6, 21867; doi: 10.1038/srep21867 (2016).

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Diese Studie wurde vom JSPS KAKENHI Grant-in-Aid for Young Scientists (A) finanziert (Fördernummer: 26701010); das Programm zur Verbreitung des Tenure-Tracking-Systems, MEXT, Japan; und das JST Accelerating Utilization of University IP Program.

Zentrum zur Förderung junger und innovativer Forscher, Nagoya Institute of Technology, Nagoya, Aichi, 466-8555, Japan

Naoko Yoshida

Electronics-Inspired Interdisciplinary Research Institute (EIIRIS), Toyohashi University of Technology, Toyohashi, 441-8580, Aichi, Japan

Naoko Yoshida, Yuko Goto, Ryugo Tero und Akira Hiraishi

Nagoya Municipal Industrial Research Institute, Nagoya, 456-0058, Aichi, Japan

Yasushi Miyata

Abteilung für Bauingenieurwesen, Nagoya Institute of Technology, Nagoya, 466-8555, Aichi, Japan

Kasumi Doi

Abteilung für Biomedizinische Wissenschaft, Hochschule für Lebens- und Gesundheitswissenschaften, Chubu-Universität, Kasugai, 487-8501, Aichi, Japan

Yuko Goto

Abteilung für Umwelt- und Biowissenschaften, Toyohashi University of Technology, Toyohashi, 441-8580, Aichi, Japan

Yuji Nagao, Ryugo Tero und Akira Hiraishi

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NY entwarf die Studie, schrieb das Manuskript und führte Experimente zur Anreicherung, Herstellung des rGO-GORB-Komplexes und elektrochemischen Kultivierung durch. YN und YG nahmen an Anreicherungsexperimenten teil. KD beteiligte sich an der elektrochemischen Kultivierung des Stammes R4. RT führte eine Analyse von GO und rGO durch und beteiligte sich an der Überarbeitung des Manuskripts. YM führte CV- und EIS-Experimente durch. AH beteiligte sich an der Dateninterpretation und überarbeitete das Manuskript.

Es bestehen konkurrierende finanzielle Interessen. Wir melden derzeit Patente für die in der Arbeit beschriebenen Methoden an.

Dieses Werk ist unter einer Creative Commons Attribution 4.0 International License lizenziert. Die Bilder oder anderes Material Dritter in diesem Artikel sind in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten, sofern in der Quellenangabe nichts anderes angegeben ist; Wenn das Material nicht unter der Creative-Commons-Lizenz enthalten ist, müssen Benutzer die Erlaubnis des Lizenzinhabers einholen, um das Material zu reproduzieren. Um eine Kopie dieser Lizenz anzuzeigen, besuchen Sie http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/

Nachdrucke und Genehmigungen

Yoshida, N., Miyata, Y., Doi, K. et al. Graphenoxid-abhängiges Wachstum und Selbstaggregation zu einem Hydrogelkomplex aus exoelektrogenen Bakterien. Sci Rep 6, 21867 (2016). https://doi.org/10.1038/srep21867

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Eingegangen: 09. Oktober 2015

Angenommen: 2. Februar 2016

Veröffentlicht: 22. Februar 2016

DOI: https://doi.org/10.1038/srep21867

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